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EFEITO DA TERAPIA CELULAR COM CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS E PROGENITORES RENAIS EM MODELOS DE NEFROTOXICIDADE AGUDA

A Lesão Renal Aguda (LRA) é uma condição comum em pacientes internados na unidade de terapia intensiva (UTI), e geralmente está associada com um mau prognóstico. Assim, com o critério “Acute Kidney Injury Network” (AKIN), a LRA pode ser definida como uma elevação dos níveis séricos de creatinina (SCr) superiores a 0,3 mg/dl dentro das 48 h, ou um aumento de 1,5 vezes do seu valor basal ou mesmo uma redução importante do volume urinário.

Ela ocorre de causa conhecida ou presumida por um evento ocorrido no prazo anterior há sete dias.

Entre os pacientes hospitalizados, a causa mais frequente da LRA é a necrose tubular aguda (NTA) causada por isquemia (hemorragias ou desidratação por exemplo) ou nefrotoxinas ou mesmo a sepse.

A taxa de mortalidade na LRA pode chegar a 50%. Nos casos em que há necessidade de diálise, os índices de mortalidade podem variar de 37% a 88%.

Devido à elevada incidência e importância da LRA para a prática médica, torna-se necessário prover novas estratégias que possam prevenir ou minimizar sua ocorrência. Assim, a terapia celular torna-se uma ferramenta inovadora. Além do que, estudos envolvendo células-tronco adultas (CTA), como as células-tronco mesenquimais (CTMs) têm mostrado resultados bastante estimulantes nos estudo pré-clínicos em animais.

As CTMs também conhecidas como células estromais mesenquimais, são células indiferenciadas auto-renováveis e multipotentes que se originam a partir da camada mesoderme. As CTMs podem se diferenciar em diferentes tipos celulares como osso, cartilagem, músculo, gordura, neurônios e cardiomiócitos. Assim, suas características vantajosas e incluem a possibilidade de usa-las para terapias como no transplante autólogos e alogênicos. Além disso, elas são desprovidas de antígenos da classe HLA o que impede que ocorram rejeições, o que se observa em transplantes de órgãos.

Em modelos experimentais de LRA ou fibrose, autores demonstraram que as CTMs derivadas da medula óssea ou o seu meio condicionado (MC) minimizam o dano renal causado pela gentamicina (antibiótico importante para infecções severas) ou obstrução ureteral unilateral (que ocorrem em várias situações que impedem a drenagem urinária).

Recentes estudos têm sugerido que o efeito benéfico das CTMs nas células lesadas não está atribuído pela sua diferenciação, mas principalmente pela ativação de mecanismos protetores e estimulação da regeneração endógena. Essa descoberta é suportada pela produção de factores solúveis bioactivos como as vesículas extracelulares (VE) do tipo microvesículas (MVs) ou exosomas (EXOs) que inibem a apoptose e fibrose, melhoram a angiogênese, estimulam a mitose (proliferação) e/ou a diferenciação de células progenitoras intrínseca do tecido, além de modular a resposta imune e favorecer a regeneração tissular. Mais ainda, em modelos experimentais onde ocorre uma importante letalidade, elas reduzem de maneira significante este evento terminal.

Em nosso laboratório, observamos que as CTMs ou seu meio condicionado bem como seus produtos extracelulares (EXOs e MV) reduzem os efeitos agressivos da LRA causada pela gentamicina, cisplatina (droga anti-neoplásica muito utilizada), LPS de Escherichia coli (toxina muito importante que participa da sepse) em ratos Wistar. Estes resultados em animais sugerem uma ação endócrina (parácrina) dessas células e seus produtos. É importante ressaltar ainda, que as CTMs permaneceram no sítio de lesão enquanto durar a agressão, modulando o fenômeno de proteção e regeneração.

Além disso, no nosso modelo de LRA por LPS em ratos, podemos observar que células residentes no tecido renal também parecem participar desse processo.

É sabido que a gentamicina é um antibiótico da classe dos aminoglicosídeos utilizados no tratamento contra infecções severas por bacterias Gram-negativas. Entretanto, seu uso é limitado devido à nefrotoxicidade que é caracterizada por alterações morfológicas, na filtração glomerular, liberação de hormônios vasoconstrictores, liberação de fator agregador de plaquetas (PAF), deposição de restos celulares obstruindo néfrons individuais e diminuição na superfície glomerular e/ou alteração na permeabilidade glomerular com diminuição do coeficiente de ultrafiltração glomerular (Kf).

Já o LPS presente na circulação sistêmica, libera produtos que ativam as células inflamatórias que infiltram o rim e liberam radicais livres de oxigênio (ROS), proteases e citocinas inflamatórias, que por sua vez lesam e ativam as células endoteliais, mesangiais e tubulares do rim. Além disso, o LPS pode estimular estas células e provocar modificações metabólicas, aumentando a produção e liberação local de substâncias pró-inflamatória que podem produzir respostas hemodinâmicas e sistêmicas que podem levar a LRA e mesmo a morte do animal.

Em nosso modelo de LRA induzido por LPS, observarvamos que a aplicação de EXOs derivados de células progenitoras renais (CPRs) ou células-tronco renais residentes, foram também capazes de promover a reparação renal. Dados demonstrados pela análise de histológica, biomarcadores renais como NGAL, KIM1 e IL18. Estas observações sugerem que provavelmente ocorre uma comunicação entre as células epiteliais tubulares com os EXOs-CPRs administrados exógenamente, e que ambos possam estar envolvidos nesse processo de reparação tecidual.

Muito se tem abordado sobre o envolvimento das CPRs na recuperação das células renais danificadas. Entretanto, a origem da regeneração renal permanece em debate. Assim, o conceito clássico estabelece que as células tubulares sobreviventes se dediferenciam, proliferam, e eventualmente relinha os túbulos desnudados, além de recuperar a integridade estrutural e funcional do rim. Hipótese alternativa é que as CPRs ou residentes renais atuem na regeneração tubular.

As CPRs têm sido detectadas em rins de mamíferos adultos usando diferentes métodos de identificação. Elas participam do turno ver celular normal de órgãos específicos e estão presentes no mesênquima metanéfrico (tecido embrionário) e podem dar origem a todos os tipos de células do rim adulto, exceto naqueles derivados do broto ureteral (BU). Estudos demonstraram que elas persistem adormecidas em nichos de rins adultos, podendo participar da formação de um novo néfron após nefrectomia parcial.

Os marcadores de superfície considerados universal para as CPRs são o CD133, CD24, Sca-1 e c-Kit, os quais têm sido encontrados em diferentes modelos experimentais e pela habilidade em diferenciação dessas células em célula epitelial renal, além de expressar uma combinação de factores de transcrição, incluindo os parálogos HOX11, OSR1, PAX2, EYA1, WT1, SIX2 e Sall.

Podemos observar que as CPRs se distribuem de forma heterogênea no rim adulto. Entretanto em rim de camundongos neonatos, elas são mais expressas em todo o tecido renal como na região cortical, medular e em papila renal. Por outro lado, na região medular, as CPRs não estão presentes em rim de ratos ou camundongos adultos. Esses dados foram demonstrados em nosso laboratório por técnicas de imunofluorescência e microscopia confocal.

Pudemos também observar também em nosso estudo, que as CPRs produzem EXOs e MVs confirmados por técnicas de microscopia eletrônica de transmissão, Nanosight, Western blot e imunofluorescência. Esses EXOs foram capazes de minimizar a nefrotoxicidade induzida por LPS em modelo in vitro e in vivo e na LRA por cisplatina em modelos experimentais em camundongos C57BL-6J. Além de observar uma maior produção de células em proliferação nos modelos de LPS e cisplatina, bem como uma melhora da função renal os EXOs de CPRs não permitiram que houvesse um aumento da necrose renal ou da apoptose (morte celular programada).

A adição de EXOs no modelo in vitro demonstrou uma melhora na viabilidade celular das células epiteliais tubulares renais e células mesangiais humanas imortalizadas (células do glomérulo) com diminuição na expressão da produção de óxido nítrico.

Em um estudo recente, autores demonstraram que o stromal cell-derived factor 1 (SDF-1) está envolvido no processo de recrutamento das células-tronco renais residentes ou CPRs e seus EXOs.

Em experimentos adicionais, ao realizarmos o pré-condicionamento (PC) das CPRs com cisplatina, LPS ou hipóxia por 12 horas, observamos uma intensa produção dos EXOs quando comparados ao grupo não PC (nPC). Dados esses, confirmados pela análise de expressão de biomarcadores precoce de lesão renal como NGAL, KIM1 e IL18 em modelo in vivo e diminuição na expressão da iNOS, caspase 3 em LLCP-K1 e CMHI. Suas expressões foram minimizadas após a administração dos EXOs-CPRs quando comparados aos grupos tratados com LPS, sugerindo que o PC prévio dessas células pode promover um maior número na produção dessas vesículas, assim induzir uma redução na toxicidade por LPS e reparação tecidual renal precoce. Esta técnica de pré-condicionamento pode, potencialmente, ser um instrumento para ensinar as células tronco a produzirem produtos de interesse e específico para cada tipo de lesão.

Em resumo, tendo em conta estes estudos experimentais envolvendo as CPRs, bem como, seus EXOs em modelo de lesão renal, podemos sugerir que ambos apresentam um notável potencial regenerativo para fins terapêuticos.

Sabendo que as CPRs podem ser previamente pré-condicionados por diferentes formas, e assim promover um aumento significativo na produção do número de EXOs e que estes são capazes de induzir a regeneração renal, também indicam potenciais ferramentas para o tratamento da LRA.

Tanto as CPRs quando seus EXOs são fáceis de serem obtidos e administrados em modelos experimentais, além de serem direcionados para o sítio de lesão, o que suporta a idéia da ação paracrina.

Por fim, observa-se que serão necessários estudos adicionais, tanto in vitro e in vivo, que visem aprofundar os potenciais mecanismos de reparação renal de seus secretomas, para tornar mais próxima à possibilidade de usá-los na prevenção ou estadiamento do curso da LRA, e reduzir o impacto renal desta situação de elevada morbidade e mortalidade. Mais ainda, necessitamos demonstrar que além de serem úteis em modelos experimentais em animais, elas atuariam também em seres humanos, sem toxidade ou teratogênese.

Autores:

Luciana Aparecida Reis

Gerson Keppeke

Maria Aparecida da Glória

Fernanda Teixeira Borges

Manuel de Jesus Simões

Rita de C Sinigáglia-Coimbra

Disciplina de Nefrologia, Dept. de Medicina. Escola Paulista de Medicina-UNIFESP

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